簡述NEST細胞培養以單管凍存細胞進行培養的實驗方案

　　NEST細胞培養是從事微生物學及生命科學研究的基本材料，在醫學領域中，診斷制品的制備，菌苗的生產、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種菌種分為母種(一級種)、原種(二級種)和栽培種(三級種)三級。
 

　　NEST細胞培養的凍存:為避免污染造成的損失，至小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。
 

　　NEST細胞培養培養是指在體外模擬體內環境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養條件等)，使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。培養物是單個細胞或細胞群。細胞在培養時都要生活在人工環境中，由于環境的改變，細胞的移動或受一些其他因素的影響，培養時間加長，傳代導致細胞出現單一化型。
 

　　NEST細胞培養下列步驟以單管凍存細胞進行培養的實驗方案為例。
 

　　1、準備一燒杯37°C的水。
 

　　2、從液氮儲存中取出一管細胞，注意保護手和眼睛。
 

　　3、擰松管蓋1/4圈，等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮，再重新擰緊管蓋。
 

　　4、將凍存管的下半部分置于37°C水浴中進行解凍，直至凍存管內僅剩余一小塊冰芯，使細胞迅速解凍。
 

　　5、用消毒液擦拭管體外表面，再將其移至II級A型層流細胞培養通風櫥中。
 

　　6、打開管蓋，使用1mL移液器上下吹打細胞懸液以分散細胞。
 

　　7、從管中吸取20uL細胞懸液，并將其稀釋于20uL臺盼藍溶液中。
 

　　8、使用血細胞計數板來確定每毫升懸液中的活細胞數。
 

　　9、將管中懸液(1mL)稀釋至產品說明中的推薦濃度。
 

　　10、將5mL細胞懸液加入25cm2培養瓶，或將15mL細胞懸浮液加入75cm2培養瓶中。
 

　　11、搖勻培養瓶中的培養基以*分散細胞。許多類型的細胞都會迅速貼壁，如果沒有在傳代后即刻搖勻細胞，細胞可能生長不均勻。
 

　　12、在37°C、5%CO2/95%空氣、濕度細胞培養箱中培養細胞。為了獲得*結果，培養開始后至少在24小時之內不要擾動細胞。